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      迎接蛋白組學(xué)樣品處理新挑戰(zhàn) ,Empore StageTips助力高通量檢測

      更新時間:2022-01-07       點(diǎn)擊次數(shù):2961

             蛋白組學(xué)脫胎于人類基因組計劃中的功能基因組學(xué),是研究細(xì)胞、組織或完整生物體所擁有的全套蛋白質(zhì)的學(xué)科,“全景式地研究在各種特定情況下的蛋白質(zhì)譜”。(賀福初,中國蛋白質(zhì)組計劃,中國科學(xué)基金,2002264-268

      蛋白組學(xué)的實驗過程高度依賴優(yōu)化的樣品前處理。其中,蛋白消解和質(zhì)譜分析這兩步之間的處理過程對整體分析質(zhì)量和靈敏度有著非常重要的影響。一種名為StageTips的關(guān)鍵技術(shù)于2003年由南丹麥大學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域?qū)W者Matthias Mann報道,并因其高效和簡便而在蛋白組學(xué)研究中得到廣泛使用。許多研究機(jī)構(gòu)根據(jù)自身課題特點(diǎn)開發(fā)了StageTips的應(yīng)用規(guī)程。

      StageTips是一種填充了Empore膜片的微量移液管。其全稱是“Stop and go extraction tips”,喻意為蛋白分解產(chǎn)生的肽被Empore膜片攔截,然后由適當(dāng)?shù)娜軇┽尫懦鰜怼_@個過程中,鹽份去除,肽得到純化和濃縮,或者預(yù)分餾。Empore膜片由高分子纖維網(wǎng)固定住的功能顆粒構(gòu)成,同時具有很好的物理特性(如柔軟、致密)和化學(xué)特性(如高保留因子),使StageTips特別適用于LC/MS分析之前處理肽溶液樣品。膜片中功能顆粒種類的多樣性使StageTips具有多種不同性能,可以根據(jù)應(yīng)用內(nèi)容有多種選擇,并可以在一支StageTips中組合使用。

       

      a - 單層Empore膜片的StageTips(放大圖中為Empore膜片材料結(jié)構(gòu)示意); b – 多層膜片的StageTips

       

       

      1 StageTips外觀

      Empore相對于用松散顆粒制成的產(chǎn)品有多種優(yōu)勢,包括:顆粒填充致密無溝流;無需篩板;洗脫體積小;容量可由增加膜片層數(shù)而擴(kuò)大。

                      

       

       

       

      2.  Empore StageTips 質(zhì)量控制:這些數(shù)據(jù)顯示SDB-RPS StageTips 在不同批次和同一批次內(nèi)測試結(jié)果的良好可重復(fù)性和可靠性,證實生產(chǎn)工藝的*性。

       

       

      應(yīng)用實例一:高通量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)檢測

      DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA要再翻譯成具有特定氨基酸序列的蛋白質(zhì)才能在體內(nèi)發(fā)揮功能,其中大部分蛋白質(zhì)往往還需要經(jīng)過化學(xué)修飾才能具備真正的活性,這種修飾稱為翻譯后修飾(PTM)。翻譯修飾的過程,就是在蛋白質(zhì)氨基酸序列中添加特定氨基酸或改變特定化學(xué)官能團(tuán)的過程,進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。已有實驗證明有三百多種潛在的PTM類型,并且同一個蛋白質(zhì)可能在多個位點(diǎn)發(fā)生修飾,這就促成了蛋白結(jié)構(gòu)和功能上的多樣性。在眾多的PTM類型中,磷酸化修飾(Phosphorylation modification)的蛋白占到了所有蛋白質(zhì)約三分之一,是普遍的修飾類型之一。會影響到細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)錄、代謝過程以及調(diào)控病原微生物的適應(yīng)能力等等,所以在不同細(xì)胞中,蛋白磷酸化水平會呈現(xiàn)不同的差異,特定位點(diǎn)的磷酸化程度可能從小于1%到大于90%。

       

      4. StageTips 用于高通量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)檢測

      磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)是研究這個蛋白質(zhì)磷酸化修飾的重要方法之一。如圖四所示,通過采用基于StageTips的高通量蛋白質(zhì)組學(xué)樣品制備方法,相對于傳統(tǒng)樣品制備方法來說,所需要的檢測樣品少了10倍,檢測時間減少3倍,但定量化磷酸化位點(diǎn)增加了3倍,提高了研究效率。

      高堿性條件下的分餾可大大提高蛋白質(zhì)檢出率。相比于傳統(tǒng)的方法,比如離線HPLC 泵,或者散裝填料裝的TipsEmpore C18 Stage Tips 更為高效,同時成本更低。圖五顯示的數(shù)據(jù)表明通過StageTips 在高堿性條件下的分餾樣品處理,蛋白質(zhì)檢出量增加了50%,同時蛋白質(zhì)覆蓋率提高了10%

       

      圖5: HeLa細(xì)胞系用 Empore C18 StageTips在高堿性條件下進(jìn)行分餾處理可大大增加蛋白質(zhì)和多肽的檢出水平

       

      Empore還具有自身優(yōu)勢,其中可供選擇的功能顆粒和應(yīng)用如下表所示。

      膜片

      C18-silica

      肽脫鹽;酸性和中性條件下的肽分餾

      C8-silica

      大分子肽和蛋白質(zhì)脫鹽;作為松散顆粒填料的篩板

      SDB-XC

      堿性條件下的肽分餾

      SDB-RPS

      RP+SCX,兼具XCSCX功能

      Anion exchange (SAX)

      用鹽和分步pH進(jìn)行肽分餾

      Cation exchange (SCX)

      用鹽和分步pH進(jìn)行肽分餾

      Chelating beads

      用途待定

      Activated carbon

      用途待定

      多層膜片

      C18-SCX

      脫鹽用鹽和分步pH進(jìn)行肽分餾

      C18-SCX-C18

      脫鹽用鹽和分步pH進(jìn)行肽分餾,然后再次脫鹽

      SDB-SAX

      脫鹽用鹽和分步pH進(jìn)行肽分餾

      膜片與顆粒結(jié)合

      金屬氧化物-C8

      磷肽富集

       

      【說明:】Empore最早由3M公司生產(chǎn),2019年,萊伯泰科從3M公司收購了Empore的生產(chǎn)線,由旗下CDS公司全面掌握生產(chǎn)工藝并生產(chǎn)和銷售。收購之后,許多將Empore作為關(guān)鍵材料的高科技產(chǎn)品得以繼續(xù)生產(chǎn)。

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